ВЭЖХ: как устроен жидкостный хроматограф и как выбрать систему для лаборатории

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ, HPLC) — основной метод контроля качества в фармацевтике и один из главных в пищевых, экологических и исследовательских лабораториях. Методом ВЭЖХ определяют действующие вещества и примеси в лекарствах, витамины, консерванты и подсластители в продуктах, микотоксины, остатки пестицидов, полиароматические углеводороды в воде. Разберём, как устроен жидкостный хроматограф, чем ВЭЖХ отличается от УВЭЖХ и газовой хроматографии, какой детектор выбрать и что проверить перед покупкой системы.

Коротко:

• ВЭЖХ разделяет вещества, растворённые в жидкости, поэтому подходит для нелетучих, термически нестойких и крупных молекул.
• Система собирается из модулей: насос, автосамплер, термостат колонок, колонка, детектор и программа. Модули подбирают под задачу.
• Чаще всего работают на обращённо-фазовой колонке C18 с УФ-детектором. Для следовых количеств и сотен веществ за один анализ нужна ВЭЖХ-МС/МС.
• Выбор начинают с методики: она задаёт давление, тип насоса, детектор и требования к данным.

Что такое ВЭЖХ и чем она отличается от газовой хроматографии

В ВЭЖХ подвижная фаза — жидкость (элюент): смесь воды с ацетонитрилом или метанолом, буферные растворы. Насос под высоким давлением прокачивает элюент через колонку, заполненную мелкими частицами сорбента — обычно 3–5 мкм, а в УВЭЖХ мельче 2 мкм. Проба, растворённая в элюенте, разделяется на компоненты, и они по очереди выходят к детектору. На хроматограмме каждому веществу соответствует пик: по времени удерживания вещество идентифицируют, по площади пика считают концентрацию.

Главное отличие от газовой хроматографии — пробу не нужно испарять. Поэтому ВЭЖХ работает с веществами, которые разлагаются при нагреве или вовсе не летучи: сахарами, аминокислотами, витаминами, белками и пептидами, большинством лекарственных субстанций, красителями, полимерами.

Подробно о газовой хроматографии — в статье газовый хроматограф: устройство, детекторы и как выбрать, а общий обзор методов — в материале хроматографические методы анализа.

Как устроен жидкостный хроматограф

Модульная конструкция удобна тем, что систему можно дооснастить: добавить второй детектор, поставить автосамплер, заменить насос. Так устроены жидкостные хроматографы Flexar: насос, детектор, дозатор и термостат подбираются под задачи лаборатории, а изократический насос можно модернизировать до бинарного или четырёхкомпонентного прямо на месте.

ВЭЖХ или УВЭЖХ: какое давление нужно

Чем мельче частицы сорбента, тем лучше разделение и короче анализ, но тем выше давление в системе. Классические колонки с частицами 3–5 мкм работают на системах ВЭЖХ с давлением до 40 МПа (около 400 бар). Колонкам с частицами мельче 2 мкм нужна ультравысокоэффективная хроматография — УВЭЖХ (UHPLC) с давлением 60–130 МПа.

• Плюсы УВЭЖХ: анализ в несколько раз быстрее, растворителей уходит меньше, пики уже и выше — чувствительность лучше.
• Минусы УВЭЖХ: система дороже, требовательнее к чистоте проб и растворителей, а перенос фармакопейной методики с ВЭЖХ на УВЭЖХ требует проверки.

Если методики написаны под классические колонки 4,6 × 250 мм, а проб немного, достаточно ВЭЖХ. Системы Flexar выпускаются в вариантах на 42 МПа (6100 psi), 69 МПа (10 000 psi) и 124 МПа (18 000 psi) — давление выбирают под колонки и методики лаборатории.

Режимы разделения и колонки

• Обращённо-фазовая ВЭЖХ. Неполярный сорбент (C18, C8) и полярный элюент (вода с ацетонитрилом или метанолом). На этом режиме построено большинство методик — от лекарств до консервантов в напитках.
• Нормально-фазовая ВЭЖХ. Полярный сорбент (силикагель) и неполярный элюент. Применяют для разделения изомеров и жирорастворимых веществ.
• HILIC. Вариант для очень полярных веществ, которые плохо удерживаются на C18.
• Ионообменная хроматография. Разделение ионов: аминокислот, органических кислот, неорганических анионов и катионов.
• Эксклюзионная (гель-проникающая) хроматография, ГПХ. Разделение по размеру молекул. Используется для определения молекулярно-массового распределения полимеров и для очистки жирных экстрактов перед анализом пестицидов — например, на системах ГПХ-очистки GPC uno / GPC quattro.

Изократический или градиентный режим. В изократическом режиме состав элюента постоянный: это проще и стабильнее, а рефрактометрический детектор работает только так. В градиентном режиме доля органического растворителя растёт по программе, и за один анализ удаётся разделить вещества с очень разной полярностью. Для разработки методик и сложных смесей нужен градиентный насос.

Детекторы ВЭЖХ: какой выбрать

К системам Flexar подключаются УФ/Вид-детекторы, детекторы на диодной матрице, флуориметрические, рефрактометрические, светорассеивающие и масс-спектрометрические — комплект собирают под задачи лаборатории.

ВЭЖХ-МС/МС: когда нужен тройной квадруполь

Если нужно определять остатки пестицидов, микотоксины, ветеринарные препараты, лекарства в биологических жидкостях или загрязнители воды на уровне микрограммов на килограмм и ниже, УФ-детектора не хватит: в сложной пробе нужный пик теряется среди мешающих веществ. Тандемный масс-спектрометр (тройной квадруполь) отбирает ион нужного вещества, дробит его и регистрирует характерные фрагменты. Это даёт и чувствительность, и подтверждение: за один анализ можно определить сотни веществ.

Пример такой системы — QSight LC/MS/MS. Её применяют для анализа пестицидов и микотоксинов в продуктах, загрязнителей в почве и сточных водах, для контроля полимеров и средств гигиены. Производитель заявляет технологию самоочистки источника ионов StayClean: по его данным, она сокращает простои на плановую чистку и даёт до 35 дополнительных рабочих дней в год.

ВЭЖХ-МС/МС дороже в покупке и обслуживании, требует подготовленного персонала, азота (обычно от генератора) и стабильного электропитания. Если задачи решаются УФ- или флуориметрическим детектированием, начинать лучше с них. Как работают масс-анализаторы, мы разбирали в статье масс-спектрометрия: принцип работы и выбор прибора.

Что анализируют методом ВЭЖХ

Как выбрать жидкостный хроматограф: чек-лист

1. Методика. Фармакопейная статья, ГОСТ, СТ РК, ISO или внутренняя методика задают колонку, состав элюента, режим, детектор и длину волны. Подбор начинают с них.
2. Давление. ВЭЖХ для классических колонок или УВЭЖХ, если нужны скорость и экономия растворителей.
3. Насос. Для одной-двух рутинных методик с постоянным составом элюента хватит изократического. Для разработки методик и сложных смесей нужен бинарный или четырёхкомпонентный.
4. Детекторы. УФ или диодная матрица — базовый вариант. Флуориметрический, рефрактометрический, светорассеивающий или масс-спектрометрический добавляют под конкретные задачи.
5. Автосамплер. Вместимость лотка, охлаждение, точность объёма ввода, минимальный перенос пробы между анализами.
6. Термостат и краны переключения колонок — если в лаборатории несколько методик.
7. Программа. Для фармацевтических производств важны журнал аудита, права доступа и электронные подписи. Системы Flexar работают с ПО Chromera или TotalChrom.
8. Помещение и инфраструктура. Вытяжка, стабильная температура, сверхчистая вода, растворители квалификации «для ВЭЖХ», сбор и утилизация отработанного элюента.
9. Сервис. Пусконаладка, квалификация оборудования для фармацевтики, обучение, запас расходников, сроки выезда инженера.

Для лабораторий, которые работают в сфере государственного регулирования, отдельно проверьте, внесён ли тип хроматографа в реестр государственной системы обеспечения единства измерений РК, и заранее договоритесь о поверке.

Расходы на эксплуатацию и как их снизить

Покупка системы — только часть затрат. В работе основные расходы — растворители высокой чистоты (особенно ацетонитрил), колонки и предколонки, флаконы и крышки, мембранные фильтры, уплотнения насоса, лампы детектора. Снизить их помогают простые правила:

• предколонка защищает дорогую аналитическую колонку от загрязнений;
• фильтрация проб и элюентов через мембраны 0,45 или 0,22 мкм бережёт насос, автосамплер и колонку;
• правильная пробоподготовка — экстракция, твердофазная очистка, ГПХ-очистка жирных экстрактов — убирает мешающие вещества, оборудование для неё есть в разделе пробоподготовка для хроматографии;
• колонки меньшего диаметра или УВЭЖХ там, где методика это допускает, снижают расход растворителя в разы;
• регулярная промывка системы и хранение колонки в рекомендованном растворителе продлевают её срок службы.

Если результаты по одной и той же пробе «плавают», причина часто не в приборе. Типичные источники расхождений мы собрали в статье почему один и тот же образец даёт разные результаты.

Вопросы и ответы

Что такое ВЭЖХ простыми словами?

Это метод, при котором жидкую пробу под высоким давлением прокачивают через колонку с мелким сорбентом. Вещества смеси проходят колонку с разной скоростью и по очереди попадают в детектор, который измеряет количество каждого.

Чем ВЭЖХ отличается от УВЭЖХ?

УВЭЖХ использует колонки с частицами мельче 2 мкм и работает при давлении 60–130 МПа против примерно 40 МПа у классической ВЭЖХ. Анализ идёт быстрее, растворителей уходит меньше, но система дороже и требовательнее к чистоте проб.

Что выбрать — ВЭЖХ или газовый хроматограф?

Зависит от веществ. Летучие и устойчивые к нагреву — газы, растворители, нефтепродукты — анализируют на ГХ. Нелетучие и разлагающиеся при нагреве — лекарства, витамины, сахара, микотоксины — на ВЭЖХ. В многопрофильной лаборатории обычно нужны оба прибора.

Какая колонка для ВЭЖХ самая распространённая?

Обращённо-фазовая колонка C18 размером 150 или 250 × 4,6 мм с частицами 5 мкм. На ней выполняется большинство рутинных методик.

Какой детектор нужен для анализа сахаров?

Сахара почти не поглощают УФ, поэтому используют рефрактометрический детектор в изократическом режиме или испарительный светорассеивающий, который работает и с градиентом. Колонку выбирают специальную — под углеводы.

Что такое градиентный режим и нужен ли он?

В градиентном режиме состав элюента меняется по программе во время анализа. Он нужен для сложных смесей, где вещества сильно различаются по полярности, и при разработке методик. Для простых рутинных анализов часто достаточно изократического режима.

Как подготовить пробу к ВЭЖХ?

Пробу растворяют в растворителе, близком по составу к элюенту, и фильтруют через мембрану 0,45 или 0,22 мкм. Для сложных проб — продуктов, почвы, биологических жидкостей — добавляют экстракцию, твердофазную или гель-проникающую очистку.

Можно ли на одном хроматографе работать по нескольким методикам?

Да. Для этого используют четырёхкомпонентный насос, термостат с кранами переключения колонок и несколько детекторов. Важно учитывать время на уравновешивание колонки при смене методики.

Сколько стоит жидкостный хроматограф?

Цена зависит от конфигурации: давления, типа насоса, количества и вида детекторов, автосамплера, программы и сервиса. ВЭЖХ-МС/МС стоит значительно дороже системы с УФ-детектором. Точную стоимость рассчитываем под вашу методику.

Подбор жидкостного хроматографа в Алматы

ТОО AsiaLab — авторизованный представитель PerkinElmer в Казахстане. Поставляем системы ВЭЖХ и УВЭЖХ Flexar, тандемные хромато-масс-спектрометры QSight LC/MS/MS, системы ГПХ-очистки проб GPC uno / GPC quattro. Поможем подобрать насос, детекторы и колонки под ваши методики, доставим по Казахстану, установим и обучим персонал. Все модели — в разделе жидкостная хроматография и в общем каталоге хроматографов.

Пришлите методику или опишите задачу — подготовим коммерческое предложение. Телефоны: +7 (727) 222-28-17, +7 (701) 710-16-45, e-mail info@asialab.kz. Офис: Алматы, пр. Абылай хана, 68-6, пн–пт с 10:00 до 18:00. Все контакты — на странице контакты.